En este programa de EUREKA (que puedes escuchar AQUI) lo dedicamos a comentar el Nobel de Química de 2020, que se le ha otorgado a la francesa Emmanuelle Charpentier y la estadounidense Jennifer Doudna por “el desarrollo de un método de edición genética”. Sin decirlo la Academia Sueca se refiere a la contribución de las galardonadas a la técnica CRISPR, una especie de tijeras genéticas que permite modificar el ADN a voluntad. Es como reescribir el ADN como se hace con un texto en el ordenador utilizando el recorta y pega. Con ello estamos en el inicio de terapias para luchar contra enfermedades, especialmente las hereditarias. Desafortunadamente no ha sido incluido Francisco Martínez Mojica (“Francis Mojica”), el profesor de la Universidad de Alicante que puso nombre a la técnica, y descubrió que las bacterias tienen su propio sistema inmune, hallazgo que abrió la puerta a la ahora premiada máquina de manipulación genética. Sensacional la conferencia dada por Mojica
Sobre lo que es la técnica CRISPR emitimos una entrevista (AQUI) a la microbióloga Margarita Díaz (profesora en la Universidad de Salamanca) que la explica con gran claridad.
Lo que no uno debe perderse es la conferencia de Dr. Francisco M. Mojica “Sistemas CRISPR-Cas, una revolución biotecnológica con origen bacteriano” que afortunadamente está grabada:
Desarrollo histórico de la técnica CRISPR-Cas9
Para quienes estén interesados en el desarrollo histórico de la técnica CRISPR-Cas9 mi compañero de programa Carlos Tejero ha preparado este exhaustivo resumen que sigue:
Para comprender el desarrollo histórico de la técnica CRISPR-Cas9, hemos seguido en detalle dos referencias. En primer lugar, el documento [1] preparado por Claes Gustafsson, miembro de la Real Academia de Ciencias de Suecia, como fundamento científico a la concesión del premio Nobel de Química de 2020. En segundo lugar, hemos utilizado el artículo [2] del genetista, biólogo molecular y matemático Eric Lander, que fue una de las fuerzas impulsoras del proyecto del genoma humano y que en la actualidad es director del Broad Institute, fundado por el MIT y la Universidad de Harvard para la investigación en biomedicina y genómica.
Hitos en el desarrollo de CRISPR-Cas9
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1993. Descubrimiento de CRISPR
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2003. CRISPR es un sistema inmune adaptativo
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2006. Evidencia experimental de la inmunidad adaptativa CRISPR
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2008. Programación de CRISPR
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2008. CRISPR tiene como objetivo al ADN
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2010. Cas9 está guiado por crARN y crea roturas de doble cadena
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2010. Descubrimiento de tracrARN
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2011. Reconstitución de CRISPR en organismos distantes
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2012. Estudio de CRISPR invitro
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2012. Edición genética en células de mamíferos
Las fechas corresponden a la primera fecha en la que los hallazgos se enviaron a publicar.
Descubrimiento de CRISPR.
Tal como se explica en [2], CRISPR fue descubierto en 1993 por Francis Mojica, científico español de la Universidad de Alicante [3]. Lo que descubrió exactamente fue que un fragmento de ADN de la arquea Haloferax mediterranei contenía múltiples copias de una sucesión palindrómica de 30 bases separadas por espaciadores de 36 bases que no se parecía a ninguna de las familias de repeticiones previamente conocidas en microbios.
Mojica descubrió en 1995 repeticiones similares en la arquea Haloferax volcanii [4]. Peinando la literatura encontró un artículo [5] de 1987 de un grupo de investigadores japoneses liderados por Y. Ishino en el que se mencionaba una sucesión de repeticiones en la bacteria Escherichia coli que poseía una estructura parecida. Sin embargo, mientras que los investigadores japoneses no hicieron apenas uso de su observación, Mojica se dio cuenta de que la presencia de estructuras similares en microbios tan diferentes debía señalar una importante función de las mismas en los procariotas, denominándolas Repeticiones Cortas Regularmente Espaciadas. Este nombre sería cambiado en 2002 por sugerencia suya a Repeticiones Palindrómicas Agrupadas Intercaladas Regularmente, que hoy conocemos como CRISPR por sus siglas en inglés, apareciendo este nombre por primera vez en el artículo de Jansen et al., [6].
Hacia el año 2000, Mojica ya había descubierto regiones CRISPR en más de 20 microbios [7]. En dos años más el censo se había doblado [6] y se habían catalogado las principales propiedades de las regiones CRISPR, incluyendo el importante paso dado con la identificación de genes CRISPR asociados (Cas) en la vecindad inmediata de dichas regiones, los cuales estaban presuntamente relacionados con la función de estas regiones.
CRISPR es un sistema inmune adaptativo.
Pero, ¿cuál era la función de los sistemas CRISPR? Hubo muchas hipótesis al respecto, la mayoría de ellas con poca o ninguna evidencia y una a una se fue demostrando que eran incorrectas. La clave del funcionamiento fue encontrada por Mojica en 2003, que había cambiado su centro de interés desde las regiones CRISPR a los espaciadores que las separaban. Lo que encontró fue un descubrimiento sorprendente: muchos de los espaciadores se correspondían con fragmentos de fagos, un tipo de virus que atacan a las arqueas y bacterias. Más importante, basándose en sus evidencias experimentales introdujo la revolucionaria hipótesis de que las regiones CRISPR debían estar relacionadas con la inmunidad de los procariotas que las contenían frente a los fagos cuyos fragmentos aparecían en los espaciadores y que en dicho proceso inmunitario intervenían los genes Cas mediante un proceso similar a la interferencia ARN en eucariotas. Esta importantísima investigación, después de ser rechazada injustificadamente en 2 revistas de máximo nivel, apareció publicada en febrero de 2005 [8].
Un grupo de investigadores franceses liderado por G. Vergnaud llegó a la misma conclusión, publicándose sus resultados un mes después del artículo de Mojica [9]. Por último, otro equipo francés encabezado por A. Bolotin envió a publicar en marzo de 2005 un artículo, que aparecería en septiembre del mismo año [10], en el que se describían resultados similares y en el que se especuló por primera vez cómo podría CRISPR conferir inmunidad, aunque a posteriori su hipótesis se demostró incorrecta.
Evidencia experimental de la inmunidad adaptativa CRISPR
En 2007, un equipo liderado por P. Horvath usó una cepa de Streptococcus thermophilus, bien caracterizada por su sensibilidad ante bacteriófagos, para efectuar selecciones genéticas con el objetivo de aislar las bacterias que eran resistentes a los fagos. Comprobaron que las cepas resistentes habían adquirido secuencias genéticas derivadas de los fagos en los separadores de las regiones CRISPR [11]. Además, estudiaron el papel de dos genes Cas: Cas7 y Cas9; demostrando que solo el último de ellos era necesario para la inmunidad y dado que ya se sabía [10] que este gen contenía dos motivos de nucleasas (HNH y RuvC), sus productos presuntamente cortarían ácidos nucleicos. Por último, encontraron casos de fagos que eran capaces de saltarse la inmunidad CRISPR y que presentaban un único cambio de bases en sus genomas en la parte correspondiente a los espaciadores de las regiones CRISPR. Así pues, demostraron que la inmunidad CRISPR dependía de una coincidencia exacta entre las secuencias de ADN del espaciador y del fago.
Referencias
[1] Gustafsson, C. (2020). Scientific Background on the Nobel Prize in Chemistry 2020. A tool for genome editing. Disponible online: https://www.nobelprize.org/uploads/2020/10/advanced-chemistryprize2020.pdf
[2] Lander, E.S. (2016). The heroes of CRISPR, Cell 164, 18-28. Disponible online: https://www.cell.com/action/showPdf?pii=S0092-8674(15)01705-5
[3] Mojica, F.J.M., Juez, G., and Rodríguez-Valera, F. (1993). Transcription at different salinities of Haloferax mediterranei sequences adjacent to partially modified PstI sites. Mol. Microbiol.9, 613–621.
[4] Mojica, F.J.M., Ferrer, C., Juez, G., and Rodríguez-Valera, F. (1995). Long stretches of short tandem repeats are present in the largest replicons of the Archaea Haloferax mediterranei and Haloferax volcanii and could be involved in replicon partitioning. Mol. Microbiol. 17, 85–93.
[5] Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., and Nakata, A. (1987). Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J. Bacteriol. 169, 5429–5433.
[6] Jansen, R., Embden, J.D.A.V., Gaastra, W., and Schouls, L.M. (2002). Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes. Mol. Microbiol. 43, 1565–1575.
[7] Mojica, F.J.M., Díez-Villaseñor, C., Soria, E., and Juez, G. (2000). Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria. Mol. Microbiol. 36, 244–246.
[8] Mojica, F.J.M., Díez-Villaseñor, C., García-Martínez, J., and Soria, E. (2005). Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements. J. Mol. Evol.60, 174–182.
[9] Pourcel, C., Salvignol, G., and Vergnaud, G. (2005). CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies. Microbiology 151, 653–663.
[10] Bolotin, A., Quinquis, B., Sorokin, A., and Ehrlich, S.D. (2005). Clustered regularly interspaced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extra-chromosomal origin. Microbiology 151, 2551–2561.
[11] Horvath, P., Romero, D.A., Coûté-Monvoisin, A.-C., Richards, M., Deveau, H., Moineau, S., Boyaval, P., Fremaux, C., and Barrangou, R. (2008). Diversity, activity, and evolution of CRISPR loci in Streptococcus thermophilus. J. Bacteriol. 190, 1401–1412.
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